一种防粘连生物膜及其制备方法,本发明是以SIS为支架材料,复合透明质酸、功能性蛋白和抗炎症药物而构成的干燥薄膜,呈浅白色至淡黄色半透明状,厚度为0.01~0.5mm。与现有技术相比,本发明防粘连生物膜的生物相容性极好,既具有良好的物理屏障防粘连作用,又具有抗炎症、止血、促进纤维降解的作用,其效果明显优于已有的各类防粘连生物膜产品。经动物实验证明,本发明制备的防粘连生物膜预防腹腔术后粘连发生的有效率达90%以上,预防盆腔术后粘连发生的有效率达80%以上,预防肌腱手术术后粘连发生的有效率达70%以上。
1.一种防粘连生物膜,其特征在于,是以SIS为支架材料,复合透明质酸、功能性蛋白和抗炎症药物而构成的干燥薄膜,干燥薄膜呈浅白色至淡黄色半透明状,厚度为0.01~0.5mm;所述的功能性蛋白为TGF-β拮抗剂和纤维蛋白溶酶原激活剂,所述的抗炎症药物为低分子量肝素和非甾体类抗炎症药物。
2.制备权利要求1所述的防粘连生物膜的方法,具体步骤包括:步骤一、消毒处理:将片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为0.5~5mol/L的碱溶液中浸泡0.5~2.5小时,然后用纯化水清洗至pH中性;步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度1~5mg/mL的胰蛋白酶溶液中浸泡0.5~4小时,再用纯化水清洗后,置于含10~25U/mL浓度DNA水解酶和30~40U/mL浓度α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡0.5~4小时,最后用纯化水清洗;步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS按需要裁剪,置于浓度为5~20mg/mL的透明质酸溶液中浸泡0.5~2小时,取出后经真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后采用辐照灭菌,辐照剂量为15~40kGy的伽马射线;步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片浸泡于无菌改性溶液中10~60秒后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.05~0.2μg/mL的TGF-β拮抗剂,5000~25000AXaICU/mL的低分子量肝素,0.1~0.5mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和0.1~1mg/mL的非甾体类抗炎症药物。技术领域
本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域,具体涉及一种防粘连生物膜及其制备方法。
背景技术
术后粘连是一种常见的手术并发症,在外科肌腱手术后通常90%以上的患者均会发生粘连现象,在腹盆腔手术后几乎有70%以上的患者发生不同程度的粘连并发症,粘连可能导致术后正常生理功能的丧失,引发肠梗阻、慢性腹痛、慢性盆腔痛及不孕等严重不良症状,甚至危及生命。目前应用于防粘连研究的材料有许多,如聚乳酸、透明质酸、纤维素、壳聚糖、硅胶、树脂和肌腱提取的胶原等,期望它们能够为组织的愈合提供暂时性的物理屏障。上述材料采用高压静电纺丝技术、冷冻干燥技术或交联聚合的方法制备成膜状或凝胶状后应用,采用聚乳酸、硅胶和树脂等原料时,通常是在溶液中添加增塑剂、防腐剂和抗氧化剂等进行聚合反应,这些成分可能对人体带来潜在的危害;以透明质酸、纤维素、壳聚糖和肌腱提取的胶原为原料制备的防粘连生物膜,其防粘连效果尚未达到临床认可。据报道,国内外广泛使用的美国健赞公司(Genzymexa0Biosurgery)生产的Seprafilm透明质酸膜,用以防止术后粘连,其结果显示有效率仅为47%(Qiqiangxa0Zeng,et,al.xa0Worldxa0Jxa0Surgxa0(2007)xa031:2125–2131),该产品是由单一的天然多糖高分子材料制备而成,只能起到初步的物理屏障作用,无法达到抑制炎症,抑制纤维化,促进愈合的效果。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的是提供一种防粘连生物膜及其制备方法,该生物膜能够暂时性替代受损组织膜,抑制术后炎症及纤维化,防止手术部位的术后粘连,具有良好的生物相容性,无排异反应,操作使用方便。本发明所提出的防粘连生物膜,其特征在于,是以脱细胞去抗原的猪小肠粘膜下层基质(smallxa0intestinalxa0submucosa,简称SIS)为支架材料,复合透明质酸、功能性蛋白和抗炎症药物而构成的干燥薄膜,干燥薄膜呈浅白色至淡黄色半透明状,厚度为0.01~0.5mm。本发明提出的防粘连生物膜的制备方法,是以SIS为支架材料,采用消毒、脱细胞去抗原、复合透明质酸、灭菌和改性处理;具体步骤包括:步骤一、消毒处理:将片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为0.5~5xa0mol/L的碱溶液中浸泡0.5~2.5小时,然后用纯化水清洗至pH中性;所述的碱溶液为氢氧化钠溶液、或氢氧化钾溶液、或氢氧化钙溶液的任一种;碱溶液具有良好的病毒灭活及杀灭细菌的能力,保证SIS原料中病毒及细菌等微生物负载降低至可接受水平,有利于后续的操作;同时能够溶解SIS中水溶性蛋白,保留SIS胶原的三维支架结构。步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度为1~5xa0mg/mLxa0的胰蛋白酶溶液中浸泡0.5~4小时,再用纯化水清洗后,置于含10~25xa0U/mL浓度DNA水解酶和30~40xa0U/mL浓度α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡0.5~4小时,最后用纯化水清洗;采用胰蛋白酶处理可对SIS中的异种细胞进行消化,并能够对SIS胶原支架结构进行适度消化,使其更有利于在体内的快速降解;同时,采用酶液处理最大限度地降低了SIS中DNA残留及α-半乳糖苷的含量,从而保证所得到的SIS具有良好的生物相容性和极低的免疫原性。步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS按需要裁剪,置于浓度为5~20xa0mg/mL的透明质酸溶液中浸泡0.5~2小时,取出后真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;在SIS复合透明质酸制备成膜片,可有效提高SIS膜片的吸水能力,在应用于临床手术时透明质酸可迅速贴附至湿润的手术部位,避免防粘连生物膜的脱落移位,能长时间有效覆盖创面,发挥防粘连生物膜的作用。步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后采用辐照灭菌,辐照剂量为15~40kGy的伽马射线;采用伽马射线辐照灭菌,既保证了SIS膜片产品达到无菌水平,也能对SIS膜片内部结构的支架造成适度破坏,以控制其在体内的降解速率,使其在降解前发挥良好的物理屏障作用,避免因降解过快而无法有效发挥防粘连作用,或是由于降解过慢而导致多种并发症发生。步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片于室温下浸泡于无菌改性溶液中10~60秒后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.05~0.2μg/mL的TGF-β拮抗剂(如核心蛋白聚糖),5000~25000AXaICU/mL(相当于每毫升肝素溶液中有5000~25000IU抗凝血因子Xa的活性)的低分子量肝素,0.1~0.5xa0mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和0.1~1xa0mg/mL的非甾体类抗炎症药物(如阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布或是塞来昔布的任一种)。本步骤对SIS膜片进行改性处理,添加可以抑制纤维化形成的功能性蛋白如TGF-β拮抗剂和纤维蛋白溶酶原激活剂等,并添加能够抑制炎症、减少出血的防粘连药物(如低分子量肝素、非甾体类抗炎症药物等),使复合了透明质酸的SIS膜片可以作为生理屏障尽可能降低受损组织在愈合再生过程中受到的创口感染影响和干扰,从而起到促进受损组织愈合的作用。本步骤最终采用晾干方式制备防粘连生物膜,可有效避免真空干燥造成的膜片结构疏松、产生大量孔隙结构而影响生物膜防粘连的效果。本发明制备的防粘连生物膜,为厚度0.01~0.5mm的薄膜,主要成分为SIS、透明质酸、功能性蛋白以及抗炎症药物,其中SIS可有效作为三维支架复合其他成分,维持膜状的物理形态,保持防粘连生物膜体内物理屏障的基本构架;透明质酸可有效吸收手术部位的组织渗液及出血,使防粘连生物膜贴敷至手术创面时可迅速呈半固态半凝胶态薄膜,不易脱落;防粘连生物膜中的功能性蛋白及抗炎症药物能有效起到抑制炎症、促进纤维降解的作用。本发明制备的防粘连生物膜,适用于腹腔、盆腔、神经、骨科、耳鼻喉等各类手术后预防手术部位术后粘连,具有极好的防粘连效果。与现有技术相比,本发明防粘连生物膜的生物相容性极好,既具有目前已有防粘连生物膜的良好物理屏障防粘连作用,又具有含抗炎症因子类防粘连生物膜(如生物羊膜)的抗炎症作用,还具有已有技术所没有的止血、促进纤维降解的作用,其效果明显优于已有的各类防粘连生物膜产品。将本发明采用大鼠腹腔防粘连动物实验证明,所制备的防粘连生物膜预防腹腔术后粘连发生的有效率达90%以上,预防盆腔术后粘连发生的有效率达80%以上,预防肌腱手术术后粘连发生的有效率达70%以上。以下通过机理分析,说明本发明技术方案的有益效果。(1)由于本发明制备方法,有效保留了SIS的三维胶原支架结构,并通过适度消化和适度辐照处理来控制SIS的降解速率,使防粘连生物膜在体内降解前发挥有效的物理屏障作用;其能够在体内完全降解吸收,避免了不可降解材料在体内导致的异物反应、长期慢性炎症等并发症。(2)由于本发明方法在SIS膜片复合透明质酸,利用了透明质酸吸收水分能力强的特性,使防粘连生物膜在手术应用时,能迅速有效贴附于各种手术创面,起到物理贴敷止血的作用,使用方便,操作简单,避免了因脱落引起的防粘连效果不佳的问题。(3)本发明的防粘连生物膜在降解时,可以释出多种功能性蛋白及抗炎症药物,为受损组织再生提供良好的抑制纤维化、抑制炎症、降低出血的生理环境,从而具有促进愈合的作用,在受损部位再生前可以作为良好的组织膜替代物,有效防止粘连发生。(4)由于本发明采用碱溶液进行脱细胞处理,易于清洗去除,而且未采用任何添加剂、交联剂、固定剂等有机化学试剂,不会造成有害试剂的残留,避免了可能导致的毒性或免疫反应。(5)由于本发明采用无菌改性液处理,可避免灭菌时对各类活性蛋白、抗炎症药物活性的影响,最大程度发挥防粘连生物膜的抑制纤维化、抑制炎症的作用效果,确保防粘连生物膜的防粘连、促进愈合的能力。(6)由于本发明采用晾干处理,避免了真空冷冻干燥对膜片造成的结构疏松、产生孔隙结构的缺点,可有效保持防粘连生物膜的无孔径结构特点,以保持良好的物理屏障功能。
附图说明
附图1xa0为本发明制备的SIS膜片的组织学切片染色结果照片,可以看出,SIS的主要成分为胶原,而且SIS膜片保持有良好的三维支架结构,有利于后续的改性处理。附图2为本发明制备的防粘连生物膜应用于创面5秒后的效果照片,可以明显看到,防粘连生物膜迅速吸收水分并有效贴附于创面,30~60秒内即可被组织渗液完全浸透,不易与组织分离脱落。附图3为采用本发明制备的防粘连生物膜进行动物有效性实验结果照片;其中A为将防粘连生物膜包裹大鼠肝脏损伤后2周的结果照片,可以明显看出,肝脏包裹处与腹腔内肠道和脏器未发生粘连,肝脏自由度良好,包裹处有部分材料剩余;B为将防粘连生物膜包裹家兔小肠后4周的结果照片,小肠与周围肠道和脏器未发生粘连;C为将防粘连生物膜包裹家兔跟腱缝合部位8周后的结果照片,肌腱与周围组织未发生粘连,肌腱愈合情况良好;D为采用防粘连生物膜包裹大鼠坐骨神经8周后的结果照片,神经愈合部位与周围肌肉组织未发生粘连,神经愈合情况良好。
具体实施方式
以下结合实例说明本发明技术方案的具体实施方式和应用效果。实例中猪小肠粘膜下层来源于Cookxa0Medical公司生产的Surgisis产品;核心蛋白聚糖购自Sinoxa0Biological,产品货号xa010189-H08H;低分子量肝素购自齐鲁制药,国药准字H20000095;纤维蛋白溶酶原激活剂购至德国Boehringerxa0Ingelheimxa0Pharmaxa0GmbHxa0&xa0Co.xa0KG,注册证号S20110051。实施例1、步骤一、消毒处理:将除去粘膜层、淋巴结的片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为0.5mol/L的氢氧化钠水溶液中浸泡半小时,然后用纯化水清洗至pH中性;步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度为1xa0mg/mL的胰蛋白酶溶液中浸泡半小时,再用纯化水清洗后,置于含25xa0U/mL的DNA水解酶和40xa0U/mL的α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡4小时,最后用纯化水清洗10次;步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS裁剪至3×4cm,置于浓度为20xa0mg/mL的透明质酸溶液中浸泡2小时,取出后真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后采用15kGy的伽马射线辐照灭菌;步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片在室温下浸泡于无菌改性溶液中1分钟后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.05μg/mL的核心蛋白聚糖,5000AXaICU/mL的低分子量肝素,0.1mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和xa0xa0xa00.1xa0mg/mL的阿司匹林。本实例所制备的防粘连生物膜采用较轻微的碱处理,透明质酸复合浓度较高,得到的膜片较厚(0.2~0.5mm),且灭菌剂量较低,使该膜片降解较慢,适用于需要较长时间隔离的肌腱、神经等部位,能够起到预防术后粘连的效果。参见附图3中C和D,该防粘连生物膜应用至肌腱、神经缝合部位,可起到良好的物理隔离作用,有效地抑制炎症,术后8周肌腱和神经愈合良好,未发生肌腱或神经坏死、再断裂,与周围组织无任何粘连发生。实施例2、步骤一、消毒处理:将除去粘膜层、淋巴结的片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为3xa0mol/L的氢氧化钠水溶液中浸泡2.5小时,然后用纯化水清洗至pH中性;步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度为1mg/mLxa0胰蛋白酶溶液中浸泡半小时,再用纯化水清洗后置于含10U/mL的DNA水解酶和30U/mL的α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡半小时,最后用纯化水清洗5次;步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS裁剪至4×6cm,置于浓度为5xa0mg/mL的透明质酸溶液中浸泡半小时,取出后经真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后进行辐照灭菌,辐照剂量为25kGy的伽马射线;步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片在室温下浸泡于无菌改性溶液中10秒后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.2μg/mL的核心蛋白聚糖,25000AXaICU/mL的低分子量肝素,0.5xa0mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和xa0xa01xa0mg/mL的布洛芬。本实例制备的防粘连生物膜采用较强的碱处理,透明质酸复合浓度较低,得到的膜片较薄(0.02~0.1mm),且灭菌剂量较高,从而使该膜片降解较快,适用于需要降解较快的腹腔、盆腔等部位,能够起到预防术后粘连的效果。参见附图3中A和B所示,该防粘连生物膜应用至腹腔肝脏、小肠手术部位后,可起到良好的物理隔离作用,有效地防止脏器、肠道粘连,术后2周肝脏自由度良好,术后4周小肠与周围肠道、脏器未发生粘连。实施例3、步骤一、消毒处理:将除去粘膜层、淋巴结的片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为1xa0mol/L的氢氧化钾水溶液中浸泡1小时,然后用纯化水清洗至pH中性;步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度为3mg/mLxa0胰蛋白酶溶液中浸泡2小时,再用纯化水清洗后置于含15U/mL的DNA水解酶和35U/mL的α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡2小时,最后用纯化水清洗7次;步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS裁剪至5×5cm,置于浓度为10mg/mL的透明质酸溶液中浸泡1小时,取出后经真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后进行辐照灭菌,辐照剂量为20kGy的伽马射线;步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片浸泡于无菌改性溶液中30秒后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.1μg/mL的核心蛋白聚糖,10000AXaICU/mL的低分子量肝素,0.3xa0mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和0.5xa0mg/mL的对乙酰氨基酚。本实例制备的防粘连生物膜,以碱处理有效去除细胞成分,采用胰蛋白酶、DNA酶和α-半乳糖苷酶处理可有效去除SIS中的能引起免疫排斥的抗原成分,在动物实验中应用至神经、肌腱、腹腔、盆腔等手术部位预防粘连时,具有良好的生物相容性,极少出现排异反应,防粘连生物膜应用部位的周围组织愈合良好,无致瘤性、无毒性,体温无异常升高,动物各项生理活动正常。实施例4、步骤一、消毒处理:将除去粘膜层,淋巴结的片状SIS用纯化水清洗至无污物,置于浓度为2xa0mol/L的氢氧化钙水溶液中浸泡2小时,然后用纯化水清洗至pH中性;步骤二、脱细胞去抗原处理:将消毒处理后的SIS置于浓度为2xa0mg/mLxa0胰蛋白酶溶液中浸泡3小时,再用纯化水清洗后置于含20U/mL的DNA水解酶和32U/mL的α-半乳糖苷酶的酶液中浸泡3小时,最后用纯化水清洗8次;步骤三、复合透明质酸:将步骤二处理后的SIS裁剪至4×4cm,置于浓度为15xa0mg/mL的透明质酸溶液中浸泡1.5小时,取出后经真空冻干得到复合有透明质酸的SIS膜片;步骤四、灭菌处理:将复合有透明质酸的SIS膜片包装后进行辐照灭菌,辐照剂量为40kGy的伽马射线;步骤五、改性处理:将得到的无菌SIS膜片在室温下浸泡于无菌改性溶液中15秒后,取出在无菌环境下晾干,无菌包装,得到防粘连生物膜;所述的无菌改性溶液是在生理盐水溶液中含有:0.15μg/mL的核心蛋白聚糖,15000AXaICU/mL的低分子量肝素,0.2xa0mg/mL的纤维蛋白溶酶原激活剂和0.8xa0mg/mL的非甾体类抗炎症药物萘普生。本实例制备的防粘连生物膜,通过与透明质酸复合,可有效利用透明质酸极强的吸收保持水分的能力,使防粘连生物膜有效吸收手术部位的组织渗液,贴附至创面不易脱落,手术操作方便,使用简单,如附图2所示。该防粘连生物膜通过改性处理,应用至动物手术部位时,具有抑制纤维化、抑制炎症、降低出血的作用,可有效防止粘连发生,应用防粘连生物膜的实验组与空白组相比,具有明显的优效结果,防粘连有效率高于空白组30~50%。